Νέα και Ανακοινώσεις - Τζάρτος Νευροδιαγνωστική

Μέτρηση στο αίμα του νέου βιοδείκτη pTau217 για τη διάγνωση της νόσου Alzheimer (με SIMOA)

Επιπλέον των μετρήσεων στο αίμα των βιοδεικτών pTau181, NFL και GFAP (με την υπερευαίσθητη τεχνολογία SIMOA) για την διάγνωση της νόσου Alzheimer (AD), προσφέρουμε πλέον και την μέτρηση του νέου βιοδείκτη pTau217 (στο πλάσμα του αίματος), ο οποίος θεωρείται υψηλότερης ευαισθησίας και ειδικότητας από τον βιοδείκτη pTau181.

Τα στάδια της AD συσχετίζονται με τα επίπεδα των Tau, φωσφορυλιωμένης Tau (pTau) και αμυλοειδών (Αβ42, Αβ40) στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ) και στο αίμα. Ο έλεγχος αυτών των βιοδεικτών στο ΕΝΥ γίνεται στο εργαστήριο μας αυθημερόν με τον αυτόματο αναλυτή Lumipulse. Η ανίχνευση ωστόσο στο αίμα πλεονεκτεί κυρίως (αλλά όχι μόνο) λόγω της αποφυγής οσφυονωτιαίας παρακέντησης.

Είναι πολύ ενδιαφέρον ότι τα τελευταία έτη η πρωτοποριακή τεχνολογία SIMOA (Single Molecule Array) παρέχει την υψηλή ευαισθησία που απαιτείται για την αξιόπιστη μέτρηση των βιοδεικτών της AD στο αίμα (πλάσμα ή ορό) με περισσότερο μελετημένο τον βιοδείκτη pTau181¹. Την τελευταία διετία έχουμε εισάγει στην Ελλάδα την τεχνολογία αυτή με την απόκτηση του αυτόματου αναλυτή SIMOA HD-X, και την αξιοποιούμε για την μέτρηση των επιπέδων pTau181 στο πλάσμα² (καθώς και τους υποστηρικτικούς βιοδείκτες αίματος NfL και GFAP) (παρουσιάζονται σε προηγούμενα ΝΕΑ – ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ).

Ωστόσο, πρόσφατα o pTau217 έχει αναδειχθεί ως ιδιαίτερα σημαντικός βιοδείκτης για την έγκαιρη ανίχνευση των ατόμων που εμφανίζουν πρώιμα σημάδια νόσησης AD.

Συγκεκριμένα, πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν ότι στο πλάσμα αίματος οι μετρήσεις του pTau217 παρουσιάζουν αυξημένη διακριτική ικανότητα αναγνώρισης των ασθενών AD σε σχέση με τον pTau181^3-5. Επίσης, ο pTau217 παρουσιάζει καλύτερη συσχέτιση με παθολογία αμυλοειδών και phosphoTau που είναι χαρακτηριστικά της νόσου AD, συνεπώς διακρίνει καλύτερα την AD από non-AD άνοιες⁶. Τέλος, μόλις τον Σεπτέμβρη 2023 στο περιοδικό ‘Nature Aging’ προτάθηκε η ενσωμάτωση στην διαγνωστική ροή εργασιών (diagnostic workflow) της μέτρησης του pTau217 στο πλάσμα⁷ ώστε να γίνεται σάρωση και επιλογή των ασθενών που παρουσιάζουν αυξημένη πιθανότητα παρουσίας AD. (Το άρθρο αυτό παρουσιάστηκε και στον ηλεκτρονικό τύπο στην Ελλάδα: π.χ. εδώ και εδώ)

Στην Τζάρτος ΝευροΔιαγνωστική εντάσσουμε πλέον και την μέτρηση του pTau217 στην προκαταρκτική διάγνωση της νόσου AD με τον αυτόματο αναλυτή SIMOA HD-X (εικόνα). Οι τιμές αναφοράς που χρησιμοποιούμε για την εκτίμηση των αποτελεσμάτων είναι σύμφωνα με πρόσφατη δημοσίευση⁸. Με αυτές τις τιμές συμφωνεί και προκαταρκτική μελέτη μας σύγκρισης των τιμών pTau217 και pTau181 στο αίμα με αυτές των βιοδεικτών της AD στο ΕΝΥ. Επίσης, παρατηρήσαμε ότι ο συνδυασμός των μετρήσεων στο πλάσμα των pTau181 και pTau217 φαίνεται να αυξάνει την ευαισθησία της προκαταρκτικής διάγνωσης της Alzheimer, αλλά αυτή η παρατήρηση πρέπει να επιβεβαιωθεί και σε μεγαλύτερες μελέτες.

Ο αυτόματος αναλυτής νέας γενιάς SIMOA HD-X (Quanterix®)

Μέτρηση νευρολογικών βιοδεικτών στο αίμα,

στην «Τζάρτος ΝευροΔιαγνωστική»

NfL (Nευροϊνίδια ελαφριάς αλυσίδας)
GFAP (Ινώδης όξινη πρωτεΐνη της γλοίας)
pTau181 (Tau φωσφορυλιωμένη στη θρεονίνη 181)
pTau217 (Tau φωσφορυλιωμένη στη θρεονίνη 217)

Βιβλιογραφία

1. Karikari, T. K. et al. Blood phosphorylated tau 181 as a biomarker for Alzheimer’s disease: a diagnostic performance and prediction modelling study using data from four prospective cohorts. Lancet Neurol 19, 422–433 (2020).

2. Tzartos, J. S. et al. Plasma P-Tau181 for the Discrimination of Alzheimer’s Disease from Other Primary Dementing and/or Movement Disorders. Biomolecules 12, 1099 (2022).

3. Palmqvist, S. et al. Discriminative Accuracy of Plasma Phospho-tau217 for Alzheimer Disease vs Other Neurodegenerative Disorders. JAMA 324, 772–781 (2020).

4. Therriault, J. et al. Equivalence of plasma p-tau217 with cerebrospinal fluid in the diagnosis of Alzheimer’s disease. Alzheimer’s & Dementia. doi: 10.1002/alz.13026 (2023).

5. Janelidze, S. et al. Head-to-head comparison of 10 plasma phospho-tau assays in prodromal Alzheimer’s disease. Brain. 146; 1592–1601. doi.org/10.1093/brain/awac333 (2022).

6. Mattsson‐Carlgren, N. et al. Soluble P‐tau217 reflects amyloid and tau pathology and mediates the association of amyloid with tau. EMBO Mol Med 13, e14022 (2021).

7. Brum, W. S. et al. A two-step workflow based on plasma p-tau217 to screen for amyloid β positivity with further confirmatory testing only in uncertain cases. Nature Aging (2023) doi:10.1038/s43587-023-00471-5.

8. Nicholas J. Ashton et al. Diagnostic accuracy of the plasma ALZpath pTau217 immunoassay to identify Alzheimer’s disease pathology. medRxiv 2023.07.11.23292493 (2023) doi:10.1101/2023.07.11.23292493.

Νέος βιοδείκτης του αίματος (GFAP) για την παρακολούθηση της σκλήρυνσης κατά πλάκας, οπτικής νευρομυελίτιδας, Alzheimer και τραυματικής εγκεφαλικής βλάβης (στη Τζάρτος ΝευροΔιαγνωστική με την υπερευαίσθητη μέθοδο SIMOA).

Η glial fibrillary acidic protein (GFAP) είναι ένα ενδιάμεσο ινίδιο των αστροκυττάρων, το οποίο συχνά εμφανίζεται σε αυξημένες συγκεντρώσεις στον ορό του αίματος ασθενών με νευρολογικές νόσους, συμπεριλαμβανομένης της σκλήρυνσης κατά πλάκας (ΣΚΠ), της νόσου Alzheimer, της οπτικής νευρομυελίτιδας (NMO), καθώς και σε τραυματική εγκεφαλική βλάβη. Όπως και τα NFL, δεν είναι ειδικός βιοδείκτης συγκεκριμένης νόσου, αλλά είναι πολύ σημαντικός βιοδείκτης για την παρακολούθηση νευρολογικών νόσων.

Ειδικότερα στη ΣΚΠ η μέτρηση της GFAP στο αίμα θεωρείται έμμεσος βιοδείκτης για την εκτίμηση της τρέχουσας προοδευτικότητας της νόσου. Σε περιπτώσεις αυξημένων επιπέδων της GFAP, φαίνεται να σχετίζονται περισσότερο με προοδευτικότητα νόσου στα επόμενα έτη παρά με οξεία φλεγμονώδη δραστηριότητα (Meier et al. 2023). Επίσης, η GFAP είναι αυξημένη και στις υποτροπές στην οπτική νευρομυελίτιδα (NMO) με AQP4 αντισώματα (Aktas et al., Ann Neurol 2021, 89:895-910).

Στην περίπτωση της μέτρησης βιοδεικτών της Alzheimer στο αίμα, ο συνδυασμός θετικού αποτελέσματος για pTau181 και υψηλών επιπέδων NFL και GFAP αποτελεί ισχυρότερη πρόβλεψη για εμφάνιση Alzheimer, από ότι το θετικό αποτέλεσμα μόνο στο pTau181 (Verberk IMW, et al.. Lancet Healthy Longevity, 2021; 2: e87–95. Teunissen CE et al. Lancet Neurol, 2022; 21:66-77, Meier et al., JAMA Neurol., 80, 287–297.2023).

Στη Τζάρτος ΝευροΔιαγνωστική, με την υπερευαίσθητη μέθοδο SIMOA (και τον αυτόματο αναλυτή HD-X), η οποία μετρά αξιόπιστα πολύ μικρές συγκεντρώσεις βιοδεικτών στο αίμα (πλάσμα ή ορό), μετά από την υιοθέτηση των μετρήσεων pTau181 και NFL στο αίμα, τώρα αναλαμβάνουμε και την μέτρηση της GFAP. Η τιμή GFAP του κάθε ασθενούς συγκρίνεται με την μέση τιμή των υγιών μαρτύρων (καθώς και ασθενών με σταθερή ΣΚΠ και ασθενών με προοδευτικά επιδεινούμενη ΣΚΠ) που αντιστοιχούν στην ηλικία, στο φύλο και στον Δείκτη Μάζας Σώματος (BMI) του εξεταζόμενου, σύμφωνα με τις σχετικές μελέτες της πρωτοπόρου ερευνητικής ομάδας του Καθ. J. Kuhle του Πανεπ. Νοσοκομείου Βασιλείας της Ελβετίας (Meier et al. 2023, JAMA Neurol. 80, 287–297.2023). Συγκεκριμένα, αυτή η μελέτη έδειξε οτι οι συγκεντρώσεις των GFAP στο αίμα γενικώς αυξάνονται με την ηλικία, μειώνονται με την αύξηση του BMI και είναι υψηλότερες στις γυναίκες απ’ ό,τι στους άνδρες.

«Ανοιχτές πόρτες» για νευρολόγους στην Τζάρτος ΝευροΔιαγνωστική

Θα θέλαμε να σας ενημερώσουμε για την νέα πρωτοβουλία μας: «Ανοιχτές πόρτες για νευρολόγους» μέσω της οποίας οι νευρολόγοι που παραπέμπουν ασθενείς τους για την εργαστηριακή διάγνωση νευρολογικών νόσων, θα μπορούν, σε μία ημέρα, να ενημερωθούν για το τι «κρύβεται πίσω» από τα αποτελέσματα που λαμβάνουν, με στόχο την καλύτερη εκτίμηση/αξιολόγηση των αποτελεσμάτων.

Συγκεκριμένα, ανάλογα με το ενδιαφέρον που θα εκδηλωθεί, θα υποδεχόμαστε κάποια πρωινά περίπου 5 νευρολόγους (ειδικούς ή ειδικευόμενους) κάθε φορά: θα γίνεται επίδειξη των περισσότερων τεχνικών που εφαρμόζουμε και της εξαγωγής των αποτελεσμάτων από 5-6 συνεργάτες μας σε περίπου 5 ώρες (0.5-1 ώρα με τον κάθε συνεργάτη). Οι επιδείξεις θα ακολουθούνται από συζητήσεις-διευκρινίσεις.

Οι τεχνικές θα αφορούν κυρίως την ανίχνευση αντισωμάτων για αυτοάνοσες νευρολογικές νόσους (με ELISA, RIA, CBA, ανοσοϊστοχημεία, western-blots, ισοηλεκτρική εστίαση), καθώς και την ανίχνευση βιοδεικτών της Alzheimer και της σκλήρυνση κατά πλάκας (στο ΕΝΥ με την αυτόματη συσκευή χημειοφωταύγειας Lumipulse και στο πλάσμα με single molecule array - SIMOA) και της CJD (με RT-QuIC).

Ολόκληρη η επίδειξη θα καλύπτεται σε ένα μόνο πρωινό.

Αισιοδοξούμε ότι αυτή η πρωτοβουλία θα αποβεί αρκετά χρήσιμη κυρίως για νευρολόγους με μικρή εργαστηριακή εμπειρία, για την καλύτερη «μετάφραση» των εργαστηριακών αποτελεσμάτων των ασθενών τους, αλλά και θα διευκολύνει την μελλοντική επικοινωνία με μέλη του εργαστηρίου μας για διευκρινήσεις επί συγκεκριμένων αποτελεσμάτων. Ασφαλώς θα χαρούμε αν επιθυμείτε να ενημερώσετε και συνεργάτες σας νευρολόγους ή ειδικευόμενους στη νευρολογία.

Οι νευρολόγοι που τυχόν ενδιαφέρονται, παρακαλώ να μας ενημερώσουν στα 2 emails: Αυτή η διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου προστατεύεται από τους αυτοματισμούς αποστολέων ανεπιθύμητων μηνυμάτων. Χρειάζεται να ενεργοποιήσετε τη JavaScript για να μπορέσετε να τη δείτε. και info@neurodiagnostics.gr, και κατά προτίμηση να μας δώσουν και την διαθεσιμότητά τους:

Ενδιαφέρομαι να παρακολουθήσω ολόκληρο πρωινό την επίδειξη στο εργαστήριο σας:

Είμαι διαθέσιμος/η τις χρονικές περιόδους:

Είμαι διαθέσιμος/η τις εργάσιμες ημέρες της εβδομάδος:

Ονοματεπώνυμο:

Ειδικότητα:

Νοσοκομείο/ιδιώτης:

Πόλη:

τηλ.:

Email:

Συνεργάτες της Τζάρτος ΝευροΔιαγνωστική θα επικοινωνήσουν με τους ενδιαφερόμενους για τις λεπτομέρειες.

Κείμενο κοινής αποδοχής (Consensus Statement) για την χρήση της μέτρησης των NfL στο αίμα, στην έρευνα και στην κλινική πράξη, για την Σκλήρυνση κατά Πλάκας

Τα νευροϊνίδια είναι οι κύριες πρωτεΐνες του κυτταρικού σκελετού των νευρικών κυττάρων, και συμμετέχουν στον σχηματισμό των νευραξόνων. Στην σκλήρυνση κατά πλάκας (ΣκΠ), καθώς και σε άλλες νευρολογικές ασθένειες όπως στην Alzheimer, όταν έχουμε βλάβη των νευρικών κυττάρων και δη των νευραξόνων, έχουμε απελευθέρωση νευροϊνιδίων ελαφριάς αλυσίδας (NfL) στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ) και σε πολύ μικρότερη συγκέντρωση στο αίμα. Με την πρωτοποριακή τεχνολογία SIMOA (Single Molecule Array)¹μπορούμε πλέον να μετρούμε αξιόπιστα τα NfL και στο αίμα (ορό ή πλάσμα).

Η τεχνολογία SIMOA, διατίθεται από την εταιρεία Quanterix®. Το μεγαλύτερο πλεονέκτημα της τεχνολογίας αυτής αποτελεί η εξαιρετικά υψηλή ευαισθησία της, περίπου 1000 φορές μεγαλύτερη από της συμβατικής ELISA¹. Το κέντρο μας, Τζάρτος ΝευροΔιαγνωστική, έχει από έτους αποκτήσει το ποιο εξελιγμένο όργανο της σειράς SIMOA, το HD-X. Με την χρήση του SIMOA HD-X από εκπαιδευμένο

προσωπικό του εργαστηρίου μας, διενεργούμε μετρήσεις βιοδεικτών, σχετικών με νευρολογικές ασθένειες, στο αίμα, όπως τους NfL και pTau181 - ιδιαίτερα γνωστούς κυρίως ως προς τις ασθένειες ΣκΠ^2,3 και Alzheimer⁴, αντίστοιχα. Ακόμη, με την ίδια τεχνολογία, εισάγουμε και την μέτρηση της πρωτεΐνης GFAP. Για την μέτρηση της GFAP στο αίμα έχει ήδη δοθεί έγκριση από το FDA, στα πλαίσια της εκτίμησης ήπιας εγκεφαλικής κάκωσης (mild traumatic brain injury) ενώ θεωρείται ως εν δυνάμει χρήσιμος βιοδείκτης για την ΣκΠ, την Alzheimer και άλλες νευρολογικές ασθενειες⁵

Για την μέτρηση των βιοδεικτών NfL και pTau181 στο αίμα με SIMOA έχει λάβει πρόσφατα η Quanterix® την ανάδειξη από το FDA των ΗΠΑ ως “Breakthrough Device Designation” τον Οκτώβριο 2021 και Απρίλιο 2022, για pTau181 και NfL αντίστοιχα. Το “Breakthrough Devices program” του FDA έχει σκοπό την ταχύτερη ανάπτυξη, αξιολόγηση και ενσωμάτωση ιατρικών οργάνων που σχετίζονται με πιο αποτελεσματική θεραπεία ή διάγνωση σοβαρών ασθενειών.

Η χρήση των NfL ως βιοδείκτης για την κλινική πράξη – (Consensus Statement)

Είναι ιδιαίτερα σημαντικό ότι η χρήση των NfL ως βιοδείκτη της ΣκΠ γίνεται πλέον όλο και περισσότερο διεθνώς αποδεκτή από τους ειδικούς για την παρακολούθηση των ασθενών στη κλινική πράξη. Ήδη τον Ιούνιο του 2021 δημοσιεύτηκε το πρώτο κείμενο κοινής αποδοχής (Consensus Statement)³ πολλών διεθνών κλινικών σχετικά με την ορθή χρήση των μετρήσεων των NfL τόσο στην έρευνα όσο και στην κλινική πράξη, για την παρακολούθηση και πρόγνωση της ΣκΠ.

Επίσης, έχει δημοσιευτεί στο Lancet Neurology (Μάρτιος 2022), η δημιουργία βάσης δεδομένων με τιμές αναφοράς για τα NfL στον ορό από το Swiss Multiple Sclerosis Cohort (SMSC)⁶. Η μελέτη αυτή συμπεριλαμβάνει και μελέτη εγκυρότητας (validation study) όπου παρουσιάζεται η προστιθέμενη αξία της μέτρησης των NfL, επιπλέον των κλινικών και MRI μετρήσεων, ιδιαίτερα για άτομα σε υψηλό ρίσκο για σοβαρή υποτροπή της νόσου και μη ικανοποιητική ανταπόκριση στις ανοσοθεραπείες. Ενώ, παρόμοια μελέτη για την δημιουργία τιμών αναφοράς για τα NfL πάλι μέσω της τεχνικής SIMOA δημοσιεύτηκε πρόσφατα (Ιούνιος 2022) στο Brain Communications⁴, από το ALzheimer’s and Families project (ALFA)⁷. H πρώτη βάση, του SMSC, επιτρέπει την εισαγωγή παραμέτρων όπως ηλικία, δείκτη μάζας – σώματος του ασθενούς που συνυπολογίζονται στο τελικό αποτέλεσμα. Αυτή είναι περισσότερο ειδική για την ΣκΠ, από την βάση του ALFA, παρέχοντας μεγαλύτερη ακρίβεια, και είναι η βάση δεδομένων που χρησιμοποιούμε στο εργαστήριο μας.

Τέλος, στα πλαίσια της συνεχιζόμενης αναβάθμισης της χρησιμότητας των NfL ως βιοδείκτη της ΣκΠ, βρίσκεται σε εξέλιξη η πρώτη προοπτική πραγματιστική (“pragmatic”) πολυκεντρική κλινική δοκιμή από το Swiss Multiple Sclerosis Cohort, με την ονομασία MultiSCRIPT prospective trial.

Βιβλιογραφία

1. Wilson DH, et al. The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing. J Lab Autom. 2016;21(4):533-547. doi:10.1177/2211068215589580

2. Gaetani L, et al. Neurofilament light chain as a biomarker in neurological disorders. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2019;90(8):870-881. doi:10.1136/jnnp-2018-320106

3. CMSC Consensus Statement on Neurofilament Biomarkers in Multiple Sclerosis. IJMSC. 2021;23(Supplement I):1-36.

4. Hansson O, et al. The Alzheimer's Association appropriate use recommendations for blood biomarkers in Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 2022 Jul 31. doi: 10.1002/alz.12756.

5. Abdelhak A, et al. Blood GFAP as an emerging biomarker in brain and spinal cord disorders. Nat Rev Neurol. 2022;18(3):158-172. doi:10.1038/s41582-021-00616-3

6, Benkert P, et al. Serum neurofilament light chain for individual prognostication of disease activity in people with multiple sclerosis: a retrospective modelling and validation study. Lancet Neurol. 2022;21(3):246-257. doi:10.1016/S1474-4422(22)00009-6

7. Simrén J. et al. Establishment of reference values for plasma neurofilament light based on healthy individuals aged 5-90 years. Brain communications. 2022;4. doi:10.1093/braincomms/fcac174

Ανάπτυξη μιας πολύ ειδικής διάγνωσης για την αυτοάνοση αυτόνομη γαγγλιονοπάθεια

Σε συνεργασία με ερευνητές από 7 Ελληνικούς ακαδημαϊκούς φορείς (5 πανεπιστημιακές κλινικές και 2 ερευνητικούς φορείς) και δύο Ευρωπαϊκές κλινικές, δημοσιεύσαμε πρόσφατα στο περιοδικό Neurology, Neuroimmunology & Neuroinflammation (Karagiorgou et al., 2022;9:e1162. doi:10.1212/NXI.0000000000001162), με i.f. 8,5, την ανάπτυξη μιας πολύ ειδικής ανοσολογικής διάγνωσης για την αυτοάνοση αυτόνομη γαγγλιονοπάθεια (autoimmune autonomic ganglionopathy, AAG) με κυτταρικό ανοσοφθορισμό (cell based assay, CBA). Η μέθοδος αυτή ξεπερνά το μεγάλο μειονέκτημα του ραδιοανοσοπροσδιορισμού (RIA) για την ανίχνευση αντισωμάτων κατά του γαγγλιονικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (α3-nAChR), συγκεκριμένα την μη ικανοποιητική ειδικότητα (για την AAG) των χαμηλών τίτλων αντι-α3-nAChR αντισωμάτων.

Συγκεκριμένα, αναπτύξαμε μια πρωτοποριακή, ευαίσθητη δοκιμασία CBA, με κύτταρα επιμολυσμένα με τον α3-nAChR για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι της εξωκυτταρικής περιοχής του α3-nAChR. Με τη μέθοδο αυτή (παράλληλα με την κλασσική RIA) ελέγξαμε ορούς από 68 ασθενείς με πιθανή ή επιβεβαιωμένη διαταραχή του αυτονόμου.

Είκοσι πέντε ασθενείς βρέθηκαν θετικοί σε αντισώματα κατά του α3-nAChR με τη RIA ενώ μόνο 15/25 ήταν θετικοί και με το CBA. Είναι ενδιαφέρον όμως ότι και οι 15 θετικοί ασθενείς με το CBA είχαν AAG, ενώ οι 10 CBA-αρνητικοί/RIA-θετικοί ασθενείς είχαν άλλες νευρολογικές ασθένειες. Κανένας ορός δεν δεσμεύτηκε σε κύτταρα χωρίς τον α3-nAChR. Επίσης ελέγξαμε και ορούς από 2600 ασθενείς με υποψία για άλλα αυτοάνοσα νευρολογικά νοσήματα, ως αρνητικούς μάρτυρες και κανείς τους δεν ήταν θετικός με το CBA.

Συμπερασματικά, δείξαμε ότι σε αντίθεση με την καθιερωμένη RIA για τα αντισώματα κατά α3-nAChR, η οποία σε χαμηλούς τίτλους είναι ανεπαρκούς ειδικότητας για την AAG, το CBA που αναπτύξαμε φαίνεται ότι είναι ειδικό για την AAG, και τουλάχιστον εξίσου ευαίσθητο με την RIA. Ήδη προσφέρουμε αυτήν την μέθοδο για την διάγνωση των αντι-α3 αντισωμάτων, η οποία είναι επίσης οικονομικότερη και ταχύτερη.

H μελέτη αυτή επίσης βραβεύτηκε στο 8^ο Πανελλήνιο Συνέδριο της Ελληνικής Ακαδημίας Νευροανοσολογίας (ΕΛ.Α.Ν.Ι.), και επιλέχθηκε για προφορικές παρουσιάσεις στο 8ο Συνέδριο της Ευρωπαϊκής Ακαδημίας Νευρολογίας (Ιούνιο 2022), στο 13ο Διεθνές Συνέδριο για την Αυτοανοσία («AUTO 2022», Ιούνιο 2022). Τέλος, είναι ενδιαφέρον ότι η οργάνωση Dysautonomia International ενδιαφέρθηκε ιδιαίτερα για την μέθοδό μας, ήδη ανακοίνωσαν την εργασία μας στο Facebook (στα Research Update) και μας κάλεσαν να την παρουσιάσουμε στο 10th Annual Conference τον Ιούλιο 2022.

Νέες εξετάσεις για δυσαυτονομία (α3), εγκεφαλίτιδες (Kelch), νευροπάθειες, μυασθένεια (αγρίνη) κ.α.

Πρόσφατα έχουμε εισαγάγει τις παρακάτω σημαντικές νέες εξετάσεις. Οι πρώτες, για αυτοάνοση δυσαυτονομία (αντι-α3-AChR με CBA) και παρανεοπλασματικές εγκεφαλίτιδες (αντι-Kelch11), έχουν αναπτυχθεί και εκτελούνται στο εργαστήριό μας, ενώ μερικές άλλες, για περιφερικές νευροπάθειες (αντι-Caspr1, και Contactin-2) και για μυασθένεια (αντι-αγρίνη), γίνονται σε συνεργαζόμενα διαπιστευμένα εργαστήρια του εξωτερικού. Επίσης σας υπενθυμίζουμε μερικές σχετικά νέες σημαντικές εξετάσεις μας για βιοδείκτες νευροεκφυλιστικών νόσων σε πλάσμα και ΕΝΥ, για τις οποίες ίσως έχετε ήδη ενημερωθεί. Συγκεκριμένα:

Α. Εξετάσεις που αναπτύχθηκαν και εκτελούνται στο εργαστήριό μας

1. Αντισώματα κατά γαγγλιονικών νικοτινικών υποδοχέων (α3-AChR) με νέα μέθοδο (κυτταρικό ανοσοπροσδιορισμό, CBA), με πολύ υψηλή ειδικότητα για την αυτοάνοση δυσαυτονομία. Την μέθοδο αυτή αναπτύξαμε και δημοσιεύσαμε πολύ πρόσφατα σε πολύ αξιόλογο περιοδικό, σε συνεργασία με Ελληνικές Νευρολογικές Κλινικές και διεθνείς συνεργάτες (Karagiorgou Κ. et al. Neurol. Neuroim. Neuroinfl. 2022). Αντίθετα από την καθιερωμένη RIA η οποία σε χαμηλούς τίτλους αντισωμάτων έχει πολύ χαμηλή ειδικότητα (~50%), η CBA που αναπτύξαμε φαίνεται ότι είναι πλήρως ειδική και τουλάχιστον εξίσου ευαίσθητη με την RIA. Περισσότερες πληροφορίες παρέχονται στην ειδική ανακοίνωση γι αυτήν την μελέτη, και για το ενδιαφέρον που έχει εκδηλωθεί από διεθνή συνέδρια και από τον οργανισμό Dysautonomia International.

2. Αντισώματα κατά του νέου αντιγόνου Kelch-like protein 11, τα οποία εντοπίζονται σε σημαντικό ποσοστό των ασθενών με παρανεοπλασματικές εγκεφαλίτιδες, και συνιστώνται κυρίως σε ασθενείς με ένα ευρύ φάσμα συμπτωμάτων όπως: παρεγκεφαλιδική συνδρομή και στελεχιαία συνδρομή, συχνά με κακοήθεια (όγκοι γεννητικών κυττάρων των όρχεων, αλλά και άλλες κακοήθειες) (Dubey D. et al. JAMA Nerology, 2020; Graus F et al. Neurol. Neuroim. Neuroinfl 2022). Και αυτά ανιχνεύονται με κυτταρικό ανοσοπροσδιορισμό (CBA). Πρέπει όμως να τονιστεί ότι το αποτέλεσμα πρέπει να εκτιμάται με επιφύλαξη και να συνεκτιμάται με άλλες διαγνωστικές εξετάσεις και με την κλινική εικόνα του ασθενούς, καθώς οι σχετικές μελέτες είναι περιορισμένες και δεν έχει γίνει ακόμη εξαντλητικός χαρακτηρισμός του φάσματος των συνδρόμων των θετικών σε αυτά τα αντισώματα.

Β. Εξετάσεις που εκτελούνται σε συνεργαζόμενα εργαστήρια του εξωτερικού

3. Δύο νέες εξετάσεις για περιφερικές νευροπάθειες τύπου CIDP: αντισώματα κατά Caspr1, και Contactin-2 (επιπλέον των ήδη προσφερόμενων εξετάσεων για αντισώματα κατά Contactin-1 και Neurofascin 155/186, με τις οποίες προσφέρονται και ως πακέτο). Η εντόπιση αυτών των αντισωμάτων σε ασθενείς με CIDP σύμφωνα με την πρόσφατη βιβλιογραφία είναι σημαντική για την επιλογή της καταλληλότερης ανοσοθεραπείας (φαίνεται ότι αυτοί οι ασθενείς δεν ανταποκρίνονται στην IVIG αλλά συχνά ανταποκρίνονται σε θεραπείες εξάντλησης των Β κυττάρων, π.χ. με Rituximab).

4. Αντι-Αγρίνη αντισώματα τα οποία ενέχονται στη βαριά μυασθένεια, με διαγνωστικό ενδιαφέρον κυρίως για την «οροαρνητική» μυασθένεια. Η αγρίνη εκκρίνεται από την νευρική απόληξη και συνδέεται και ενεργοποιεί την LRP4 η οποία με την σειρά της συνδέεται και ενεργοποιεί την MuSK.

Επίσης σας υπενθυμίζουμε ότι πρόσφατα αναλάβαμε στο εργαστήριο μας την μέτρηση βιοδεικτών της νόσου Alzheimer στο πλάσμα του αίματος με την επαναστατική τεχνολογία SIMOA: Συγκεκριμένα την μέτρηση του ειδικού για την Alzheimer βιοδείκτη pTau181, και του γενικού βιοδείκτη για νευροεκφυλιστικές νόσους, NFL (για Alzheimer, σκλήρυνση κατά πλάκας κ.α.). Τέλος υπενθυμίζουμε ότι η μέτρηση των τεσσάρων βιοδεικτών στο ΕΝΥ για Alzheimer και ασθένεια Creutzfeldt-Jacob γίνεται πλέον εντός 24 ωρών με την τεχνολογία Lumipulse.

Μέτρηση βιοδεικτών της Alzheimer στο αίμα με την πρωτοποριακή τεχνολογία SIMOA, στο εργαστήριο μας

Με την τεχνολογία SIMOA (και τον αυτόματο αναλυτή HD-X της Quanterix), που έχουμε πρόσφατα εγκαταστήσει στο εργαστήριο μας, εκτελούμε πλέον τον προκαταρκτικό έλεγχο για τη διάγνωση, πρόγνωση και παρακολούθηση της νόσου Alzheimer με τη μέτρηση του βιοδείκτη pTau181 στο πλάσμα του αίματος των ασθενών.

Την παρούσα περίοδο εξελίσσεται μια επανάσταση στη διάγνωση της νόσου Alzheimer. Συγκεκριμένα, με εξαιρετικά ευαίσθητες τεχνικές (κυρίως με την τεχνολογία SIMOA, single-molecule array) επιτυγχάνεται η αξιόπιστη μέτρηση βιοδεικτών της νόσου Alzheimer στο πλάσμα του αίματος του ασθενή. Έχει ήδη δειχθεί σε κορυφαία επιστημονικά περιοδικά (π.χ. δημοσιεύσεις 1-19) ότι ειδικά η μέτρηση των επιπέδων της φωσφορυλιωμένης Tau (pTau) στο πλάσμα παρέχει μια πολύ σημαντική διαγνωστική ένδειξη για την Alzheimer.

Αν και έχει δειχθεί επανειλημμένα ότι η pTau181 στο πλάσμα αποτελεί σημαντικό μη επεμβατικό βιοδείκτη για τη διάγνωση, πρόγνωση και παρακολούθηση της πορείας της νόσου (1-19), οι μετρήσεις αυτές είναι ακόμη σε πειραματικό στάδιο, και τα αποτελέσματα πρέπει να αξιολογούνται με επιφύλαξη. Το «θετικό αποτέλεσμα» δεν είναι παθογνωμονικό αλλά κυρίως συνιστά τη διενέργεια περαιτέρω εξετάσεων.

Οι μέσες τιμές ευαισθησίας και ειδικότητας της μεθόδου μεταξύ ασθενών με Alzheimer και «υγιών» από 4 μεγάλες μελέτες ήταν 89% και 86% αντίστοιχα (4,8,9,15). Σε δικές μας μελέτες σε συνεργασία με άλλα κέντρα (π.χ. J. Tzartos et al., Biomolecules, 2022, 12, 1099. https://doi.org/10.3390/biom12081099) η ευαισθησία και ειδικότητα της Alzheimer έναντι ασθενών με άλλες άνοιες είναι τουλάχιστον 72% και 76%, αντίστοιχα, με cut-off τα 2.9 pg/ml, ενώ στα 4.0 pg/ml η ειδικότητα φτάνει το 86%.

Παράλληλα, μετρούμε πλέον στο εργαστήριο μας και τα NFL (πάλι με SIMOA), τα οποία αν και δεν είναι ειδικά για τη νόσο Alzheimer, μπορεί να είναι χρήσιμα για την παρακολούθηση της πορείας της νόσου.

Οι ασθενείς μπορούν να έρχονται στο διαγνωστικό μας για αιμοληψία για μέτρηση της pTau181 (ή και των NFL), με προσιτό κόστος. Εντός Αττικής υπάρχει δυνατότητα και για αιμοληψία κατ’οίκον, ενώ, κατόπιν συνεννόησης, μπορεί να μας αποστέλλεται πλάσμα του αίματος των ασθενών από όλη την Ελλάδα με courier.

Τέλος, υπενθυμίζουμε ότι ο έλεγχος των 4 βιοδεικτών της Alzheimer στο ΕΝΥ (β-αμυλοειδή-42/40, Tau, pTau) γίνεται στο εργαστήριο μας αυθημερόν με τον αυτόματο αναλυτή Lumipulse.

Βιβλιογραφία

Bayoumy S, et al. Clinical and analytical comparison of six Simoa assays for plasma P-tau isoforms P-tau181, P-tau217, and P-tau231. Alzheimers Res Ther. 2021. 13(1):198.
Chatterjee P, et al. Diagnostic and prognostic plasma biomarkers for preclinical Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 2021.
Cullen NC et al. Individualized prognosis of cognitive decline and dementia in mild cognitive impairment based on plasma biomarker combinations. Nature Aging 2021. 1:114-123.
Ding X, et al. Ultrasensitive assays for detection of plasma tau and phosphorylated tau 181 in Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. Transl Neurodegener. 2021. 10(1):10.
Gonzalez MC, et al. Association of Plasma p-tau181 and p-tau231 Concentrations With Cognitive Decline in Patients With Probable Dementia With Lewy Bodies. JAMA Neurol. 2021 Nov 22:e214222.
Janelidze S, et al. Plasma P-tau181 in Alzheimer's disease: relationship to other biomarkers, differential diagnosis, neuropathology and longitudinal progression to Alzheimer's dementia. Nat Med. 2020. 26:379-386.
Karikari TK, et al. Blood phosphorylated tau 181 as a biomarker for Alzheimer's disease: a diagnostic performance and prediction modelling study using data from four prospective cohorts. Lancet Neurol. 2020. 19(5):422-433.
Karikari TK, et al. Diagnostic performance and prediction of clinical progression of plasma phospho-tau181 in the Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative. Mol Psychiatry. 2021 26:429-442.
Lantero Rodriguez J, et al. Plasma p-tau181 accurately predicts Alzheimer's disease pathology at least 8 years prior to post-mortem and improves the clinical characterisation of cognitive decline. Acta Neuropathol. 2020. 140(3):267-278.
Lleó A, et al. Phosphorylated tau181 in plasma as a potential biomarker for Alzheimer's disease in adults with Down syndrome. Nat Commun. 2021. 12(1):4304.
Lussier FZ, et al. ; Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative. Plasma levels of phosphorylated tau 181 are associated with cerebral metabolic dysfunction in cognitively impaired and amyloid-positive individuals. Brain Commun. 2021. 3: fcab073.
Mielke MM, et al. Comparison of Plasma Phosphorylated Tau Species With Amyloid and Tau Positron Emission Tomography, Neurodegeneration, Vascular Pathology, and Cognitive Outcomes. JAMA Neurol. 2021, 78:1108-1117.
Moscoso A et al. Longitudinal Associations of Blood Phosphorylated Tau181 and Neurofilament Light Chain With Neurodegeneration in Alzheimer Disease. JAMA Neurol. 2021. 78:396-406.
Moscoso A, et al. Time course of phosphorylated-tau181 in blood across the Alzheimer's disease spectrum. Brain. 2021. 144(1):325-339.
O'Connor A, et al. Plasma phospho-tau181 in presymptomatic and symptomatic familial Alzheimer's disease: a longitudinal cohort study. Mol Psychiatry. 2020.
Suárez-Calvet M, et al. Novel tau biomarkers phosphorylated at T181, T217 or T231 rise in the initial stages of the preclinical Alzheimer's continuum when only subtle changes in Aβ pathology are detected. EMBO Mol Med. 2020 Dec 7;12(12):e12921.
Therriault J, et al.. Association of plasma P-tau181 with memory decline in non-demented adults. Brain Commun. 2021. 3(3):fcab136.
Thijssen EH, et al. Diagnostic value of plasma phosphorylated tau181 in Alzheimer's disease and frontotemporal lobar degeneration. Nat Med. 2020 .26:387-397.
Wang YL, et al. Plasma p-tau181 Level Predicts Neurodegeneration and Progression to Alzheimer's Dementia: A Longitudinal Study. Front Neurol. 2021 Sep 7;12:695696.

Ypourgeio ependyseisFLNEAETPA 700

ΔΡΑΣΗ ΕΘΝΙΚΗΣ ΕΜΒΕΛΕΙΑΣ: «ΕΡΕΥΝΩ-ΔΗΜΙΟΥΡΓΩ-ΚΑΙΝΟΤΟΜΩ»

ΤΙΤΛΟΣ: Βιοδείκτες σε αυτοάνοσα νευρολογικά νοσήματα

ΑΚΡΩΝΥΜΙΟ: NeuroMarkers

ΚΩΔΙΚΟΣ ΕΡΓΟΥ Τ1ΕΔΚ-05024

MIS 5031816

ΦΟΡΕΙΣ:

Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ

Τζάρτος ΝευροΔιαγνωστική

ΠΡΟΫΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ: 689.040 €

Το NeuroMarkers στοχεύει στην ανάπτυξη νέων διαγνωστικών δοκιμασιών όπου νέα αντισώματα έναντι νευρωνικών νικοτινικών υποδοχέων της ακετυλοχολίνης (nAChRs) θα χρησιμοποιούνται ως βιοδείκτες για την παρακολούθηση νευροανοσολογικών παθήσεων.

Οι nAChRs διακρίνονται σε μυϊκούς και νευρωνικούς. Ο μυϊκού τύπου βρίσκεται στη νευρομυϊκή σύναψη και μετατρέπει τις νευρικές ώσεις σε μυϊκές συσπάσεις. Είναι το κύριο αντιγόνο στην αυτοάνοση νόσο μυασθένεια (myasthenia gravis, MG) όπου τα αυτοαντισώματα καταστρέφουν τους nAChRs. Οι νευρωνικού τύπου nAChRs διακρίνονται σε πολλούς υπότυπους και είναι ευρέως κατανεμημένοι στο νευρικό σύστημα και σε αρκετούς μη-νευρικούς ιστούς. Ρυθμίζουν τη νευρωνική διεγερσιμότητα μέσω νευροδιαβιβαστών. H απώλεια ή δυσλειτουργία νευρωνικών nAChRs, σχετίζεται με πολλές νευρολογικές και νευροψυχιατρικές ασθένειες, όπως Parkinson, Alzheimer, αυτισμό, σχιζοφρένεια κ.α.

Πρόσφατα, αυτοαντισώματα έναντι άλλων συναπτικών υποδοχέων, συνδέθηκαν με την πρόκληση συμπτωμάτων που συνθέτουν ένα φάσμα εκδηλώσεων, χαρακτηριστικών της αυτοάνοσης εγκεφαλίτιδας και συναφών συνδρόμων (autoimmune encephalitis and related syndromes, AES). Η AES είναι η αιτία του >20% των περιπτώσεων εγκεφαλίτιδας. Ωστόσο, πολλοί AES ασθενείς είναι οροαρνητικοί για τα γνωστά αντισώματα, καθιστώντας αναγκαία την ταυτοποίηση νέων αντισωμάτων για την έγκαιρη διάγνωση, σωστή θεραπεία και πρόγνωση.

Οι νευρωνικοί nAChRs αποτελούν υποψήφια αυτοαντιγόνα στην AES, καθώς είναι σημαντικοί στη διανευρωνική επικοινωνία στον εγκέφαλο, ενώ γενετικές μεταλλάξεις τους έχουν συνδεθεί με τα βασικά συμπτώματα της AES. Κύριο ρόλο στην AES παίζει ο ιππόκαμπος, καθώς είναι βασικό τμήμα του μεταιχμιακού συστήματος, στον οποίο συχνά παρατηρούνται βλάβες κατά την εμφάνιση της ασθένειας, αλλά και η πλειονότητα των γνωστών αντιγόνων της AES εκφράζονται στην περιοχή αυτή. Είναι ενδιαφέρον, ότι στον ιππόκαμπο εκφράζονται και αρκετές υπομονάδες του νευρωνικού nAChR.

Επιπλέον, αρκετοί μυασθενείς έχουν πρόσθετα νευρολογικά συμπτώματα, τα οποία είναι παρόμοια με αυτά της AES και μπορεί να οφείλονται στην διασταυρούμενη αντίδραση των αντισωμάτων του μυϊκού nAChR με νευρωνικούς nAChRs ή στην παραγωγή ειδικών αυτοαντισωμάτων μετά από epitope spreading.

Με βάση την εμπειρία μας στους nAChRs, στην ταυτοποίηση νέων αυτοαντιγόνων, στην ανάπτυξη διαγνωστικών δοκιμασιών και σε ενθαρρυντικά προκαταρκτικά πειράματα, θα διερευνήσουμε τους νευρωνικούς nAChRs ως αυτοαντιγόνα σε οροαρνητικούς ασθενείς με πιθανή AES.

Στα πλαίσια του έργου NeuroMarkers, προτείνουμε:

Παραγωγή των nAChR-αυτοαντιγόνων
Έλεγχο της παθογονικότητας των αυτοαντισωμάτων
Ανάπτυξη ευαίσθητων τεχνικών ανίχνευσης νέων nAChR αντισωμάτων
Αναζήτηση αυτοαντισωμάτων έναντι των νευρωνικών nAChRs σε AES και MG ασθενείς
Συσχέτιση των νέων αυτοαντισωμάτων με κλινικά συμπτώματα και παρακολούθηση της AES

Ο χαρακτηρισμός νέων βιοδεικτών και η ανάπτυξη νέων διαγνωστικών θα μειώσει το ποσοστό των ασθενών με εγκεφαλίτιδα άγνωστης αιτιολογίας και θα συμβάλλει στη σωστή παρακολούθηση και έγκαιρη ανοσοθεραπεία, στη μείωση της θνησιμότητας και του κόστους νοσηλείας. Μακροπρόθεσμα, η γνώση του μηχανισμού δράσης των ειδικών αντισωμάτων θα διευκολύνει την ανάπτυξη ειδικών θεραπευτικών προσεγγίσεων.

ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΕΙΣ ΠΟΥ ΠΡΟΕΚΥΨΑΝ ΑΠΟ ΤΗΝ ΥΠΟΣΤΗΡΙΞΗ ΤΗΣ ΧΡΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗΣ

Δημοσιεύσεις
- A novel cell-based assay for alpha-3 nicotinic receptor antibodies detects antibodies exclusively in autoimmune autonomic ganglionopathy. K. Karagiorgou, M. Dandoulaki, R. Mantegazza, F. Andreetta, R. Furlan, J. Lindstrom, P. Zisimopoulou, E. Chroni, P. Kokotis, E. Anagnostou, D. Tzanetakos, M. Breza, Z. Katsarou, G. Amoiridis, V. Mastorodemos, M. Bregianni, A. Bonakis, G. Tsivgoulis, K. Voumvourakis, S. Tzartos, and J. Tzartos. Neurology: Neuroimmunology & Neuroinflammation 2022 Mar 29;9(3):e1162. doi: 10.1212/NXI.0000000000001162. 2022

Προφορικές παρουσιάσεις:
- Novel antigens in autoimmune neurological disorders. 5η Ημερίδα Μεταπτυχιακών και Μεταδιδακτόρων Εληνικού Ινστιτούτου Παστέρ, 26 Σεπτεμβρίου 2019, Αθήνα
- Μια νέα πρωτοποριακή τεχνική κυτταρικού ανοσοφθορισμού, ανιχνεύει αντισώματα κατά του αλφα-3 νικοτινικού υποδοχέα αποκλειστικά σε ασθενείς με αυτοάνοση αυτόνομη γαγγλιοπάθεια (αναρτημένη και προφορική ανακοίνωση). 8ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ελληνικής Ακαδημίας Νευροανοσολογίας. 16-19 Δεκεμβρίου, 2021, Θεσσαλονίκη. Βράβευση της ανακοίνωσης
- A novel cell-based assay for alpha-3 nicotinic receptor antibodies detects antibodies exclusively in autoimmune autonomic ganglionopathy patients. 13^th International Congress on Autoimmunity (AUTO 2022), Athens, Greece, 10 -13 June 2022 (δεκτή για προφορική ανακοίνωση)
- A novel cell-based assay detects antibodies against alpha3-nAchR exclusively in autoimmune autonomic ganglionopathy. 8ο Συνέδριο του European Academy of Neurology (8th EAN Congress), June 25-28, Vienna, Austria. δεκτή για αναρτημένη και προφορική ανακοίνωση)
- A sensitive serological assay that detects antibodies against alpha3-nAchR exclusively in autoimmune autonomic ganglionopathy patients. Dysautonomia International's 10^th Annual Conference, July 14-17, 2022. Καλεσμένη ομιλία.

Αναρτήσεις σε συνέδρια
- Novel autoantibodies as biomarker in autoimmune encephalitis and related syndromes. 130 Years of Institut Pasteur. Celebrating Science. May 15-17, 2019, Institut Pasteur, Paris
- Live Cell Based Assay for the detection of autoAbs against LRP4. 130 Years of Institut Pasteur. Celebrating Science. May 15-17, 2019, Institut Pasteur, Paris
- Novel autoantibodies as biomarker in autoimmune encephalitis and related syndromes. 70ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ελληνικής Εταιρείας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, 29 Νοεμβρίου – 1 Δεκεμβρίου 2019, Αθήνα
- Novel autoantibodies as biomarker in autoimmune encephalitis and related syndromes. 7ο Πανελλήνιο Forum Νέων Επιστημόνων Ελληνικής Εταιρείας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, 28 Νοεμβρίου 2019, Αθήνα

Ενημερώνουμε τους επισκέπτες και συνεργάτες μας ότι όλο το τακτικό προσωπικό της Τζάρτος ΝευροΔιαγνωστική έχει εμβολιαστεί κατά της covid-19. Επίσης λαμβάνουμε όλα τα μέτρα που απαιτούνται για την ασφάλεια του προσωπικού και των επισκεπτών μας κατά της μόλυνσης από τον κορωνοϊό SARS-CoV-2.

Σελίδα 1 από 5