Α. ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΑ ΝΕΑ ΤΗΣ ΤΖΑΡΤΟΣ ΝΕΥΡΟΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ

Σε συνεργασία με το Τμήμα Νευροβιολογίας του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ, με το Τμήμα Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών και με πολλές άλλες Ελληνικές και διεθνείς ερευνητικές ομάδες, δραστηριοποιούμαστε στα ακόλουθα:

α. AQP1 αντισώματα στην οπτική νευρομυελίτιδα (ΝΜΟ)

Το κύριο αυτοαντιγόνο στην οπτική νευρομυελίτιδα (neuromyelitis optica, ΝΜΟ) είναι η aquaporin-4 (AQP4) η οποία εντοπίζεται στα αστροκύτταρα που ελέγχουν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό. Ωστόσο, το 20-50% των ΝΜΟ ασθενών δεν έχουν AQP4 αντισώματα. Τα αστροκύτταρα όμως εκφράζουν και aquaporin-1 (AQP1) και αναρωτηθήκαμε αν μερικοί ΝΜΟ ασθενείς έχουν AQP1 αντισώματα αντί για AQP4 αντισώματα. Σε συνεργασία με τον Αναπλ. Καθ. Νευρολογίας Κ. Κιληντηρέα, βρήκαμε ότι πολοί ασθενείς με πιθανή ΝΜΟ, ή με παρόμοια συμπτώματα, έχουν AQP1 αντισώματα (J. Tzartos et al, PLOS-1, 2013). Προσπαθούμε τώρα να καταλάβουμε τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά της AQP1-ΝΜΟ.

β. LRP4 αντισώματα στη μυασθένεια

Η LRP4 βρίσκεται στη μετασυναπτική μεμβράνη της νευρομυϊκής σύναψης και σε συνεργασία με την MuSK και την αγρίνη προκαλεί την απαραίτητη συσσώρευση των AChRs στη μετασυναπτική μεμβράνη. Μετά την ανακάλυψη των LRP4 αντισωμάτων σε «οροαρνητικούς» μυασθενείς σε 3 δημοσιεύσεις το 2011-12, στη μία από τις οποίες συμμετείχαμε κι εμείς, αναπτύξαμε ένα ευαίσθητο διαγνωστικό τεστ και ηγήθηκε μιας πανευρωπαϊκής μελέτης (εργαστήρια και κλινικές από 10 κράτη με 635 «οροαρνητικούς» μυασθενείς) για τη μελέτη της LRP4-μυασθένειας. Δείξαμε ότι το 19% των «οροαρνητικών» μυασθενών έχουν LRP4 αντισώματα, ενώ κανείς από τους 90 υγιείς μάρτυρες δεν ήταν θετικός. Είδαμε ότι οι LRP4 μυασθενείς παρουσιάζουν ηπιότερα συμπτώματα στην έναρξη της νόσου απ ότι οι άλλες ομάδες μυασθενών. Αντίθετα, η συνύπαρξη LRP4 αντισωμάτων με αντι-AChR ή αντι-MuSK αντισώματα (η οποία δεν είναι σπάνια) σχετίζεται με βαρύτερα συμπτώματα απ ότι η παρουσία ενός μόνο είδους αντισωμάτων (P. Zisimopoulou et al., J. Autoimmunity, 2013). Ακολούθησαν και μελέτες περιπτώσεων (case studies) για τη λεπτομερή παρατήρηση των χαρακτηριστικών της LRP4 μυασθένειας (Zouvelou et al. Neuromusc. Disord 2013; Tsivgoulis et al. J. Neurol. Sci. 2014).

γ. LRP4 αντισώματα στην ALS

Είναι ενδιαφέρον ότι ανιχνεύσαμε αντι-LRP4 αυτοαντισώματα και στο 23% (24/104) των ασθενών με τη νόσο του κινητικού νευρώνα (ALS) από Ελλάδα (με Μ. Ρέτζο, Ν. Καρανδρέα και συν.) και Ιταλία (με R. Mantegazza και συν.) (J. Tzartos et al, Ann. Clin.Trans.Neurol, 2013). H LRP4, επιπλέον της παρουσίας της στη μετασυναπτική μεμβράνη της νευρομυϊκής σύναψης, με κρίσιμο ρόλο στη λειτουργία του AChR, βρίσκεται και στους κινητικούς νευρώνες παίζοντας κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη και λειτουργία τους. Είναι επομένως πιθανό αυτά τα LRP4 αντισώματα να παίζουν παθογόνο ρόλο στην ALS, με ελκυστικές θεραπευτικές προoπτικές. Είναι ακόμη προς διερεύνηση οι τυχόν διαφορές μεταξύ των αντι-LRP4 αντισωμάτων των μυασθενών και αυτών των ALS ασθενών, καθώς και η ερμηνεία της πιθανά διαφορετικής παθογένειάς τους. Ωστόσο, η παρουσία LRP4 αντισωμάτων σε αρκετούς ALS ασθενείς επιβάλει την προσοχή στην αξιολόγηση του θετικού αποτελέσματος για LRP4 αντισώματα στη διάγνωση της μυασθένειας.

δ. Ανάπτυξη νέων διαγνωστικών για νέα και γνωστά αντιγόνα

Είμαστε στη διαδικασία ανάπτυξης ενός διαγνωστικού για αντι-αγρίνη αντισώματα στη μυασθένεια, και ενός πολύ ευαίσθητου διαγνωστικού για την ανίχνευση αντι-τιτίνη αντισωμάτων στην οροαρνητική μυασθένεια.

ε. Ερευνητικές Χρηματοδοτήσεις στη Τζάρτος ΝευροΔιαγνωστική

i. Χρηματοδότηση για την «Ανάπτυξη εργαλείων σχετικών με την κατανόηση και διάγνωση νευροανοσολογικών παθήσεων».

Η Τζάρτος ΝευροΔιαγνωστική, επέτυχε, ως συντονιστής, χρηματοδότηση από την ΓΓΕΤ (σε συνεργασία με το εργαστήριό μας στο Ε.Ι. Παστέρ και με Ισραηλινά εργαστήρια). Η χρηματοδότηση αφορά κυρίως την προώθηση των ερευνών μας προς την ανάπτυξη νέων διαγνωστικών για την οπτική νευρομυελίτιδα (αντισώματα κατά της ακουαπορίνης-1) και την μυασθένεια (αντισώματα κατά της αγρίνης).

ii. Συμμετοχή σε χρηματοδότηση από την Ευρωπαϊκή Επιτροπή (έργο: Muscle Stress Relief)

Η Τζάρτος ΝευροΔιαγνωστική συμμετέχει σε μεγάλο Ευρωπαϊκό πρόγραμμα, με συντονιστή τον καθ. Siegfried Labeit, το οποίο πρόσφατα εγκρίθηκε κατ αρχήν για διαπραγματεύσεις με την Ευρωπαϊκή Επιτροπή. Η συμβολή μας αφορά κυρίως τη μελέτη των αντι-τιτίνη αντισωμάτων στη μυασθένεια, και τη βελτίωση των τεχνικών ανίχνευσης αυτών των αντισωμάτων τα οποία αναμένεται να αποτελέσουν ένα νέο βιοδείκτη για την οροαρνητική μυασθένεια.

 

Β. ΔΙΕΘΝΗ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΑ ΝΕΑ

Κατά καιρούς θα παρουσιάζουμε ενδιαφέροντα ερευνητικά νέα από την διεθνή βιβλιογραφία, σχετικά με τον ραγδαία αναπτυσσόμενο τομέα της νευροανοσολογίας.

 α. Τα αντι-MOG αντισώματα πιθανόν να εμφανίζονται συχνότερα από τα αντι-AQP4 στο φάσμα διαταραχών NMO

Την τελευταία διετία αποκτά αυξανόμενο ενδιαφέρον η ανίχνευση αντισωμάτων κατά της MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein) για τη διάγνωση του φάσματος ασθενειών της οπτικής νευρομυελίτιδας (neuromyelitis optica spectrum disorders, NMOsd). Τα αντι-MOG αντισώματα σε απομυελινωτικές νόσους ήταν γνωστά από πολλά έτη, αλλά προφανώς λόγω ατελειών στις μεθόδους ανίχνευσης, στερούντο ειδικότητας. Με την ανάπτυξη βελτιωμένων μεθόδων (με κυτταρικό ανοσοφθορισμό, CBA) δείχθηκε πρόσφατα από μερικές ερευνητικές ομάδες ότι τα αντι-ΜOG αντισώματα εμφανίζονται ειδικά σε αρκετούς (10-25%) ΝΜΟ ασθενείς, οροαρνητικούς σε AQP4. Πολύ ποιό ενδιαφέρουσα όμως είναι μια πολύ πρόσφατη δημοσίευση της ομάδος της Α. Vincent  (Πανεπ. Οξφόρδης) σε συνεργασία με άλλες διεθνείς ομάδες (Waters et al. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2015;2(3):e89. doi: 10.1212/NXI.0000000000000089). Αρχικά έδειξαν ότι κλειδί για την ανίχνευση αντι-MOG αντισωμάτων ειδικών για μη-MS απομυελινωτικές νόσους είναι ο αποκλεισμός των αντισωμάτων της IgM τάξης. Μελέτησαν ορούς από 1100 ασθενείς για τους οποίους είχε ζητηθεί διάγνωση αντι-AQP4 αντισωμάτων (δηλαδή ασθενείς με υποψία για NMOsd).  Εντόπισαν πάνω από 65 ορούς θετικούς σε αντι-MOG αντισώματα της ΙgG1 υπόταξης, ενώ μόνο 40 ασθενείς είχαν αντι-AQP4 αντισώματα (και μόνο ένας ήταν διπλοθετικός). Δεν ανιχνεύθηκαν αντι-MOG αντισώματα της ΙgG1 υπόταξης σε ορούς υγιών ατόμων ούτε σε MS ασθενείς. Αντίθετα, μεταξύ 58 ασθενών με κλασσική NMO, 37 (64%) είχαν AQP4 αντισώματα και μόνο 8 (14%) είχαν MOG αντισώματα.

Η MOG-NMOsd εμφανίζεται σχεδόν εξίσου συχνά σε άνδρες και γυναίκες, φαίνεται ότι επικρατεί η οπτική νευρίτιδα αλλά εμφανίζεται και επιμήκης μυελίτιδα, με πιο συχνή συμμετοχή του μυελικού κώνου και των βασικών γαγγλίων. Συνήθως έχει σημαντικά καλύτερη πρόγνωση από την AQP4-NMOsd.

 

β. Η μέτρηση των επιπέδων Tau και p-Tau στο ΕΝΥ είναι ποιό σημαντική από τη μέτρηση των επιπέδων της 14-3-3 για τη διάγνωση της Creutzfeldt-Jacob disease.

Η ανίχνευση της πρωτεΐνης 14-3-3 στο ΕΝΥ θεωρήθηκε αρχικά ως πολύ ειδική και ευαίσθητη για τη διάγνωση της CJD. Ωστόσο αργότερα βρέθηκε ότι η 14-3-3 ελευθερώνεται στο ΕΝΥ και σε άλλες ασθένειες με εκτενή απώλεια νευρώνων. Στις σχετικές δημοσιεύσεις η ευαισθησία της 14-3-3 συνήθως κυμαίνεται μεταξύ 85% και 95%, αλλά η ειδικότητά της μεταξύ 40% και 100%.

Αν και η μέτρηση της 14-3-3 παραμένει να έχει σχετική αξία για τη διάγνωση της CJD, η μέτρηση των επιπέδων της Tau και της φωσφορυλιωμένης Tau (p-Tau) στο ΕΝΥ φαίνεται ότι προσφέρουν μεγαλύτερη ειδικότητα και ευαισθησία. Πρόσφατες μεγάλες μελέτες  (Skillbäck et al., JAMA Neurol, 2014, 71:476-83; Forner et al. Neurol Clin Pract, 2015; και editorials: H. Wood, Nat Rev Neurol, 2014, 10:180, και Couthart & Ances, Neurol Clin Pract, 2015) επιβεβαίωσαν μερικές προηγούμενες μικρότερες μελέτες που είχαν δείξει την αξία των υψηλών τιμών Tau και του λόγου Tau/p-Tau στη διάγνωση της CJD. Η μέτρηση της p-Tau έχει ιδιαίτερη σημασία για την διαφοροποίηση από την Alzheimer διότι ενώ η ολική Tau αυξάνεται και στις δύο ασθένειες (αν και γενικώς αυξάνεται περισσότερο στην CJD), η p-Tau δεν αυξάνεται στην CJD.

Στη μεγαλύτερη από αυτές τις μελέτες, οι Skillbäck και συν. (JAMA Neurol, 2014, 71:476-83) μελέτησαν τα ΕΝΥ από 93 επιβεβαιωμένους στην αυτοψία CJD ασθενείς και ~10.000 μη CJD ασθενείς από τη Σουηδική βιοτράπεζα, και επιβεβαίωσαν προηγούμενες μικρότερες μελέτες ότι ο συνδυασμός υψηλής τιμής Tau (>1400 ng/L) και υψηλού λόγου Tau/p-Tau (>25) αποτελεί αξιόπιστη παράμετρο για τη διάγνωση της CJD. Συγκεκριμένα οι μετρήσεις τους έδειξαν 99% ειδικότητα and 79% ευαισθησία για CJD.  Συντηρητικότερος λόγος Tau/p-Tau (>17 αντί για >25) είχε ελαφρώς μικρότερη ειδικότητα (97%) αλλά αρκετά μεγαλύτερη ευαισθησία (93,6%).

Συμπερασματικά, ο συνδυασμός των μετρήσεων των επιπέδων των τριών δεικτών (14-3-3, Tau και p-Tau) προσφέρει πολύ εγκυρότερη διάγνωση από αυτήν ενός μόνο δείκτη.

γ. Μερικά αυτοαντισώματα είναι λιγότερο ειδικά από άλλα

Είναι γνωστό ότι η ανίχνευση αυτοαντισωμάτων έναντι ενός αντιγόνου ενεχόμενου σε ένα αυτοάνοσο νόσημα, ακόμη και όταν τέτοια αντισώματα μπορούν να προκαλέσουν το νόσημα σε πειραματόζωα, δεν αποτελεί απόλυτη πιστοποίηση ύπαρξης της εν λόγω ασθένειας. Συνήθως χρειάζονται και συμπληρωματικοί παράγοντες για την εκδήλωση της ασθένειας. Γι αυτό η κάθε εξέταση πρέπει να γίνεται μόνο σε ασθενείς με υποψία για την εν λόγω ασθένεια και πρέπει να συνδυάζει ο γιατρός τα εργαστηριακά με τα κλινικά ευρήματα για την τελική διάγνωση. Οι Dahm και συν (Ann. Neurol, 2014, 76:82-94) μελέτησαν ορούς από 1703 υγιείς και 2533 ασθενείς με νευροψυχιατρικές νόσους για την ύπαρξη αυτοαντισωμάτων έναντι 24 αντιγόνων του εγκεφάλου. Μάλιστα μελέτησαν ξεχωριστά τις τάξεις IgG, IgM και IgA των αυτοαντισωμάτων.

Βρήκαν εντυπωσιακά υψηλά ποσοστά ορών με αντι-NMDAR1 αντισώματα σε υγιείς μάρτυρες (~8,5% των υγιών) και αρκετά μικρότερα αλλά σημαντικά ποσοστά για αντισώματα έναντι amphiphysin (2.2%), ARHGAP26 (1.4%), CASPR2 (0.7%), MOG (0.5%), GAD65 (0.5%), Ma2 (0.5%), Yo (0.6%), και Ma1 (0.5%).  Τα ποσοστά θετικών ορών υγειών για αντισώματα έναντι άλλων αντιγόνων (anti-AMPAR-1/2, AQP4, CV2, Tr/DNER, DPPX-IF1, GABAR-B1/B2, GAD67, GLRA1b, GRM1, GRM5, Hu, LGl1, recoverin, Ri, ZIC4) ήταν χαμηλά (≤0.1%) αλλά υπαρκτά. Αποκλεισμός των IgM αντισωμάτων και επικέντρωση στην ανίχνευση IgG αντισωμάτων βελτίωσε δραματικά την εικόνα για τα αντι-NMDAR1 αντισώματα (από 8,5% σε ~1.2% των υγιών), και σημαντικά μερικών άλλων αυτοαντισωμάτων, αλλά και πάλι το πρόβλημα υπάρχει. Συμπερασματικά, ψευδώς θετική ανοσολογική διάγνωση δεν μπορεί να αποκλειστεί, αλλά η επικέντρωση στην ανίχνευση IgG αντισωμάτων συχνά βελτιώνει σημαντικά τη διάγνωση. Επίσης, ψευδώς θετικά αποτελέσματα μειώνονται πολύ με τον έλεγχο του ΕΝΥ, ιδιαίτερα στην περίπτωση των αντι-NMDAR1 αντισωμάτων. Επειδή η συλλογή του ΕΝΥ δεν είναι εύκολη, μπορεί να συνιστάται μόνο σε περίπτωση θετικού ορού, αν ο κλινικός χρειάζεται περαιτέρω επιβεβαίωση για την τελική διάγνωση (κυρίως για NMDAR αντισώματα).